找回密码
 注册新帐号

QQ登录

只需一步,快速开始

[分子生物]

蛋白研究系列专题9-ChIP实验技术之经验分享

梦见宾 发表于 2017-3-31 11:14  
查看: 100478|回复: 0|显示全部楼层 |阅读模式


染色质免疫沉淀技术(ChromatinImmunoprecipitation,简称ChIP)是研究活体内蛋白质与DNA相互作用的一种技术。它利用抗原抗体反应的特异性,可以真实地反映体内蛋白因子与基因组DNA结合的状况。随着对基因功能研究的不断深入,这项技术正越来越多的被应用于科研的各个领域。


ChIP的原理

把生理状态下的细胞内的DNA与蛋白质交联在一起,通过超声或酶处理将染色质切为小片段后,利用抗原抗体的特异性识别反应,将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来,然后可进行后续的DNA序列测序鉴定等。
ChIP实验步骤

ChIP经验分享
ChIP实验操作性很强,金开瑞根据多年的实践,总结了一些ChIP实验中您可能会遇到的棘手的问题,下面我们就一起来分享一下吧!                  细胞固定
1、甲醛终浓度为1%较适宜;
2、固定时间一般为5-60min较好,具体时间根据实验而定。
染色质断裂
1、超声时断时续,保证低温;
2、注意探头位置,防止产生泡沫;
3、研究组蛋白需使用酶处理;
染色质免疫沉淀
1、最好有Input对照,Input对照不仅可以验证染色质断裂的效果,还可以根据Input中的靶序列的含量以及染色质沉淀中的靶序列的含量,按照取样比例换算出ChIP的效率,所以Input对照是ChIP实验必不可少的步骤。
2、抗体的选择是关键。抗体的选择要注意三点:一是应该选择能够做ChIP实验的抗体。尽量选择ChIP级别商业化的抗体。如没有,一般可以重组到带有标签的载体上,再转染相应的宿主(目前市面上商业化的chip抗体只有300多种,因此正好找到对应抗体较困难,可以选择标签抗体)。二是抗体的结合位点。选择单抗的话,尽量远离抗原和染色质相结合的位点,这样可以最大限度保证抗体和抗原的结合,而多抗可识别多个表位,可基本避免该风险。因此单多抗各有优缺点,应重点关注该抗体是否经过ChIP验证。三是抗体的浓度。抗体浓度的也很重要,浓度太低,不能与靶蛋白完全结合。浓度太高会导致非特异性条带增加背景。
3、阴性对照可以使用血清或lgG,阳性对照一般使用RNA Polymerase II或者组蛋白。
阴性对照:用实验抗体同型的IgG作为抗体,理论上不会ChIP下来任何DNA片段,因此作为阴性对照,但是由于非特异结合,或者实验过程中,没发生结合的DNA清除不完全,可能也会出现条带。如果阴性对照样品中的产物量等于特异靶标样品中产物量,说明特异靶标抗体未发挥作用或者染色质断裂不充分。
阳性对照:为了保证阳性对照有效,一般选择阳性对照的引物是根据管家基因设计的。一般用RNA Polymerase II或者Histone H3(组蛋白)抗体,因为RNA Polymerase II是通用转录因子,在所有细胞中都能结合基因的核心启动子区。因此,理论上ChIP后PCR都会有条带。
4、需设计已经确定的、不与特异抗原相结合的DNA片段的引物,用来排除抗原和染色质的非特异结合。

交联反应的逆转
1、RNA酶、蛋白酶需65℃保温6小时
2、不加蛋白酶可以提取、分析结合蛋白
DNA的纯化
1、最好用试剂盒,便于后面的PCR检测
DNA的鉴定
1、可以进行二代测序或者QPCR检测结果
因为ChIP实验涉及的步骤多,结果的重复性较低,所以对ChIP实验过程的每一步都应设计相应的对照,而且对结果的分析也需要有一定的经验。如果ChIP实验方面有什么问题,欢迎与我们交流哦!



本帖子中包含更多资源

您需要 登录 才可以下载或查看,没有帐号?注册新帐号

x
您需要登录后才可以回帖 登录 | 注册新帐号

本版积分规则  | 请遵守小木虫学术科研第一站管理条例,不得违反国家法律法规

Copyright 2014-2018 小木虫学术科研第一站(xmuchong.com)All Rights Reserved.

公安备案:津公网安备 12011102000110号

      

ICP备案/许可证号:津ICP备14003772号-3

      

跟帖评论自律管理承诺书

      

统一社会信用代码:911201110731367936